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本试剂盒可以完成酿酒酵母感受态制备，感受态冻存，转化实验。最突出的优点可一次性制备200支感受态，-80℃冰箱可冻存一年，后续酵母转化实验无需重新制备感受态，操作简单快速，该试剂盒的转化效率与经典酵母转化试剂盒基本相同。如需进一步提高酵母转化效率，可选用我公司的Super酵母感受态制备与转化试剂盒Plus或单独购买YPD Plus液体培养基，转化产物用YPD Plus复苏，其转化效率可以提高50～100%。

• 转化全程要求无菌操作。
  
• 为了保证转化效率，务必缓慢冻存感受态，感受态不宜直接用液氮冻存。
  
• 增加酵母质粒的纯度和浓度可以提高转化效率。

• 感受态细胞的制备：
  按小体积转化制备20支感受态计，可按比例扩大
  
  • 活化菌种。-80℃保存的菌种在YPDA培养基平板上划线，30℃培养2～4天。
    
  • 挑取酵母单菌落在YPDA培养基平板上划3～5mm的短线，30℃培养2～4天。
    
  • 待酵母单菌落直径长至2mm时，把酵母细胞接种到3mL液体YPDA培养基中，30℃过夜培养。
    
  • 第二天转接到含有50mL液体YPDA培养基的三角瓶中继续培养，待OD600达到0.4-0.5，3000rpm离心5min，弃上清。(4℃保存1周内的酵母菌液，用3mL接种50mL YPDA培养基过夜培养)
    
  • 用10mL Y1溶液重悬沉淀，3000rpm离心5min，弃上清。
    
  • 加1mL Y2溶液重悬，按50μL分装于1.5mL无菌冻存管，转文库按600μL分装，感受态细胞制备完毕，可直接用于转化。
    
  • 制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后，再置于-80℃冰箱长期保存。将感受态细胞放入程序降温盒，或用多层纸包裹放入泡沫盒中，先置于-80℃冰箱过夜后，再取出感受态置于-80℃冰箱，可保存一年。使用前室温融化后用于转化。
• 转化预混液配制：
  

  成分	质粒转化预混液	文库转化预混液
  Y3溶液	350μL	2520μL
  质粒	5～10μL(≈200ng/μL)	5～15μg(文库质粒)
  总体积	360μL(ddH2O补足体积)	2592μL(ddH2O补足体积)

  
  
• 酵母质粒转化：
  
  • 吸取360μL预混液加入50μL感受态细胞中，反复吹吸沉淀，使酵母细胞完全悬浮于预混液中。
    
  • 30℃的水浴锅中热激60min，每10min混匀一次。对于部分菌种，延长孵育时间可提高转化效率，但不要超过3小时。
    
  • 12000rpm离心15 s，弃上清。
    
  • 可选步骤：用0.5mL YPD Plus液体培养基重悬沉淀，30℃摇床震荡培养30～60min。12000rpm离心15s，弃上清。
    
  • 加入400μL无菌去离子水或0.9%氯化钠溶液重悬菌体，涂筛选培养基平板，30℃培养2～4天。
• 酵母文库转化：
  需用15～50mL离心管
  
  • 将2592μL预混液加入到600μL感受态细胞中，震荡使感受态细胞充分悬浮于预混液中。
    
  • 30℃的水浴锅中热激90min，每10min混匀一次。对于部分菌种，延长孵育时间可提高转化效率，但不要超过3小时。
    
  • 3000rpm离心5min，弃上清。
    
  • 可选步骤：用3mL YPD Plus液体培养基重悬沉淀，30℃摇床震荡培养90min，3000rpm离心5min，弃上清。
    
  • 加入15mL无菌去离子水或0.9%氯化钠溶液重悬菌体，涂筛选培养基平板，30℃培养2～4天。